依維莫司(Everolimus)和二甲雙胍治療乳腺癌細胞具有協同作用

　　在許多實驗系統中，依維莫司（Everolimus）抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 并導致蛋白質合成減少和癌細胞增殖減少。腺苷 5'-單磷酸活化蛋白激酶 (AMPK) 激活劑，如二甲雙胍，與將 AMPK 激活與 mTOR 抑制聯系起來的 TSC2/1 通路具有相似的作用。乳腺癌的組織病理學和生化研究顯示 AMPK 和 mTOR 通路經常失調。因此，我們研究了 mTOR 抑制劑依維莫司和二甲雙胍治療乳腺癌細胞的療效。本研究評估了依維莫司單獨或與二甲雙胍聯合對乳腺癌細胞的體外和體內作用。MTT法用于量化藥物對體外乳腺癌細胞的抑制作用。用注射了 HCC1428 細胞的 SCID 小鼠進行了不同的治療，以評估不同藥物的體內功效。數據顯示，依維莫司和二甲雙胍的組合對培養和小鼠異種移植模型中的乳腺癌細胞的生長具有協同抑制作用。此外，這種組合消除了 S6 和 4EBP1 磷酸化�？偟膩碚f，我們建議依維莫司和二甲雙胍的組合可能是治療乳腺癌的有效方案，因此需要在臨床上進一步評估該組合。

　　來自臨床前研究的累積證據表明，二甲雙胍對腫瘤疾病的臨床過程，特別是對乳腺癌的臨床過程發揮積極作用，主要是通過刺激與上游肝激酶 B1 (LKB1) 相關的 AMPK。AMPK 是一種關鍵的細胞能量傳感器，二甲雙胍對其的激活會抑制能量消耗過程，例如糖異生、蛋白質和脂肪酸合成，并且在 2 型糖尿病患者中，會導致高血糖和胰島素抵抗的代謝正�；�。在癌細胞中，由二甲雙胍介導的 AMPK 刺激導致抑制 mTOR/核糖體 S6 激酶途徑，從而抑制病理性細胞周期進程、細胞生長和血管生成。同樣，二甲雙胍對 AMPK 的刺激會顯著抑制雌激素受體 α (ERα) 陰性和陽性人乳腺癌細胞系中的細胞增殖。

　　磷脂酰肌醇 3-激酶 (PI3K)/蛋白激酶 B (AKT)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 活性的失調在乳腺癌中經常發生。依維莫司或其類似物對 mTOR 活性的抑制導致細胞周期進程、存活和抗凋亡所需的蛋白質的翻譯抑制，從而在體外和體內抑制乳腺腫瘤的生長和進展。然而，依維莫司作為單一藥物在實體瘤中的活性是有限的。依維莫司有限的臨床益處可能與抑制 PI3K/AKT 活性的 mTOR 依賴性反饋回路有關。依維莫司（Everolimus）通過抑制 mTOR，不僅抑制蛋白質翻譯，而且抑制這個反饋回路，導致 AKT 活化增加。這反過來可能會限制這類藥劑的一些抗增殖作用。最近公布的數據表明，通過 AMPK 激活二甲雙胍暴露導致的 mTOR 抑制降低了 AKT 激活，這一作用與依維莫司的作用相反。這些發現表明，通過將二甲雙胍與依維莫司聯合化療藥物的治療方案結合，抗腫瘤療效可能會進一步增強。

　　這項研究首次證明依維莫司（Everolimus）與二甲雙胍聯合使用可在體外和體內抑制乳腺癌細胞的生長。在以前的研究中，干細胞被認為對抗腫瘤藥物具有抗藥性�？鼓[瘤藥物會殺死占腫瘤內大部分細胞的分化細胞，但不影響少數干細胞。在本研究中，我們還發現，與單獨用藥相比，依維莫司和二甲雙胍聯合用藥對乳腺CSCs有顯著抑制作用。

　　首先，我們研究了依維莫司（Everolimus）和二甲雙胍對乳腺癌細胞系的體外抗癌作用，結果表明依維莫司（Everolimus）或二甲雙胍可抑制不同乳腺癌細胞系的增殖，包括 HCC1428、MDA-MB-468 和 BT549 細胞系。濃度依賴性方式。然后，我們在一組乳腺癌細胞系中研究了依維莫司和二甲雙胍對腫瘤細胞增殖的組合作用。令我們驚訝的是，當在二甲雙胍治療方案中加入依維莫司時，細胞增殖抑制作用進一步增強。由于依維莫司和二甲雙胍組合在體外對乳腺癌細胞具有良好的生長抑制作用，我們還驗證了該組合對小鼠乳腺癌腫瘤生長的功效。依維莫司和二甲雙胍的組合顯著抑制了 HCC1428 異種移植物的生長，而單獨使用依維莫司或二甲雙胍在測試劑量下僅最小或部分抑制 HCC1428 異種移植物的生長，通過腫瘤大小和重量測量。此外，該組合在抑制異種移植物的生長方面明顯比每種單一藥物更有效（p < 0.01 與依維莫司或二甲雙胍組相比）。這些體外和體內數據進一步證明依維莫司和二甲雙胍的組合顯示出增強的抗癌活性。

　　以前的研究已經確定了 CSC 在乳腺癌生長、侵襲、轉移和化療耐藥中的關鍵作用。因此，我們評估了依維莫司與二甲雙胍聯合是否可以顯著抑制乳腺 CSC。我們進行了乳腺球形成試驗以確定依維莫司和二甲雙胍是否可以協同抑制乳腺癌細胞的干性。結果表明，對照組HCC1428細胞產生更多更大的球體。依維莫司和二甲雙胍的組合顯著抑制了 HCC1428 乳腺球的生長，而單獨的依維莫司或二甲雙胍在測試劑量下僅最小或部分抑制了 HCC1428 乳腺球的生長。此外，與單獨的依維莫司或二甲雙胍組相比，依維莫司+二甲雙胍組的聯合治療觀察到顯著更大的CD44+/CD24-細胞抑制作用。

　　為了了解依維莫司（Everolimus）和二甲雙胍組合發揮增強抗癌活性的機制，我們分析了組合對 S6 和 4EBP-1 磷酸化的影響，它們是翻譯抑制因子，當被 mTOR 磷酸化時其作用減弱。依維莫司或二甲雙胍單獨降低 HCC1428 細胞系中 p-S6 和 p-4EBP-1 的水平。與單獨的依維莫司或二甲雙胍相比，在依維莫司 + 二甲雙胍細胞中觀察到 p-S6 和 p-4EBP-1 的水平顯著降低。此外，我們發現單獨使用依維莫司或二甲雙胍可部分降低 p-S6 和 p-4EBP-1 水平。然而，它們的組合在降低異種移植腫瘤中 p-S6 和 p-4EBP-1 水平方面比任何一種單一藥物都更有效，這表明依維莫司和二甲雙胍的組合對 S6 和 4EBP-1 磷酸化的抑制也有增強作用體內。我們的研究結果表明，這種組合可以為乳腺癌治療提供新的策略。這種效果可能與序列有關，

　　綜上所述，本研究的體內和體外結果表明，依維莫司（Everolimus）和二甲雙胍聯合用藥可以在一定程度上增強各單藥對乳腺癌細胞的抑制作用。這種組合為乳腺癌患者提供了一種新的治療選擇。然而，這些藥物的聯合作用仍需要大規模的臨床試驗進一步驗證。

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