樂伐替尼聯合依維莫司增強抗腫瘤活性的基礎

　　在轉移性腎細胞癌 ( RCC ) 的II期臨床研究中，與依維莫司單藥治療相比，多受體酪氨酸激酶抑制劑樂伐替尼與哺乳動物雷帕霉素靶點 (mTOR) 抑制劑依維莫司的組合顯著改善了臨床結果。我們研究了臨床前RCC模型中聯合治療抗腫瘤活性的潛在機制。樂伐替尼加依維莫司在三種人類腎細胞癌中顯示出比任一單一療法更強的抗腫瘤活性異種移植小鼠模型（A-498、Caki-1 和 Caki-2）。特別是，該組合導致 A-498 和 Caki-1 模型中的腫瘤消退。在 A-498 模型中，依維莫司顯示出抗增殖活性，而樂伐替尼顯示出抗血管生成作用。在 Caki-1 異種移植物中，樂伐替尼加依維莫司組合增強了抗血管生成活性，其中成纖維細胞生長因子 (FGF) 驅動的血管生成可能有助于腫瘤生長。該組合在血管內皮生長因子 (VEGF ) 激活中主要表現出加性活性，在細胞增殖和管形成測定中顯示出對FGF激活的內皮細胞的協同活性，以及強烈抑制的mTOR-S6K-S6 信令。在攜帶過表達VEGF或FGF的人胰腺KP-1 異種移植物的小鼠中，也觀察到該組合與每種單一療法相比具有增強的抗腫瘤活性。我們的結果表明，樂伐替尼加依維莫司同時靶向腫瘤細胞生長和血管生成導致抗腫瘤活性增強。該組合增強了對VEGF和FGF信號通路的抑制作用，這是其在人類RCC異種移植模型中具有優異抗血管生成活性的基礎。

　　我們在此表明，在三種人類 RCC 異種移植小鼠模型中，樂伐替尼與依維莫司的組合比任一單一療法發揮更大的抗腫瘤活性。此外，樂伐替尼加依維莫司治療導致三個模型中的兩個（A-498 和 Caki-1）的腫瘤消退。然而，各種治療對腫瘤微血管的影響在這兩種模型中有所不同：樂伐替尼單藥治療能夠降低兩種模型中的 MVD，而依維莫司單藥治療僅導致 Caki-1 異種移植物的 MVD 降低。僅在該模型中也注意到了對 MVD 的組合效應。因此，在 Caki-1 模型中，該組合顯示出更大的抗腫瘤活性是抗血管生成活性提高的結果，而在 A-498 模型中，這似乎是由于抗血管生成活性的組合樂伐替尼具有依維莫司的抗增殖活性。我們的數據表明，樂伐替尼加依維莫司在人類 RCC 模型中增強的抗腫瘤作用是通過兩種不同的作用機制實現的。

　　VHL基因的突變是透明細胞 RCC 中最常見的遺傳改變，即使在常氧條件下也會導致 HIF-1α 和 HIF-2α 的誘導。A-498 是 VHL 缺陷型 RCC 細胞系，而已知 Caki-1 表達野生型 VHL，表明無論 VHL 狀態如何，樂伐替尼都可以發揮抗血管生成活性。盡管僅在具有野生型 VHL 的 Caki-1 異種移植物中觀察到對腫瘤血管生成的聯合作用，但我們在本研究中僅檢查了少數細胞系，因此 VHL 狀態與聯合抗血管生成活性之間的關系值得進一步研究。

　　在 Caki-2 異種移植模型中，即使使用樂伐替尼加依維莫司，我們也沒有觀察到腫瘤消退。據報道，周細胞覆蓋的血管對抗血管生成治療具有相對耐藥性，我們之前曾報道，在一組臨床前腫瘤異種移植模型中，周細胞覆蓋血管的百分比可能預測樂伐替尼的活性。6Caki-2腫瘤組織中基質細胞相對豐富，一般由癌相關成纖維細胞和壁細胞組成，大部分微血管位于基質區域（數據未顯示）。因此，即使與依維莫司聯合使用，Caki-2 異種移植物的腫瘤微環境狀態也可能影響對侖伐替尼的敏感性，需要進一步研究以闡明潛在機制。

　　Lenvatinib 通過阻斷 VEGFR 和 FGFR 來抑制 Erk1/2 和 S6K-S6 信號傳導。相反，依維莫司影響 mTOR 通路而不影響 Erk1/2 的磷酸化，但完全抑制 S6K (Thr389) 的磷酸化，后者主要被 mTOR 復合物磷酸化。然而，依維莫司抑制的 S6K (Thr421/Ser424) 和 S6 (Ser235/Ser236) 的磷酸化作用弱于 S6K (Thr389)。相比之下，樂伐替尼加依維莫司的聯合治療對 mTOR-S6K-S6 通路，特別是 S6K (Thr421/Ser424) 和 S6 (Ser235/Ser236) 磷酸化有更大的抑制作用。先前的報道表明，在 mTOR 復合物的下游，S6K 和 S6 也可以被 Erk1/2 信號激活，分別在 Thr421/Ser424 和 Ser235/Ser236 殘基處發生磷酸化。因此，除了依維莫司對 mTOR 的直接抑制外，對 S6K 和 S6 的更大抑制可能是由于樂伐替尼阻斷了 S6K-S6 通路（mTOR 下游）中的 Erk1/2 交叉信號傳導�？偟膩碚f，我們的結果表明，樂伐替尼對 MAPK 通路的抑制作用以及樂伐替尼加依維莫司對 mTOR-S6K-S6 通路的抑制作用增強了藥物組合對 VEGF 和 FGF 驅動的血管生成的抑制作用。

　　越來越多的證據表明，FGF 作為促血管生成因子發揮作用，并且 FGF 信號通路的激活是逃避抗 VEGF 治療的潛在機制，包括在 mRCC 中。鑒于：(i) FGF 介導的血管生成似乎在 Caki-1 異種移植模型中的腫瘤生長中起主要作用； (ii) lenvatinib 加依維莫司治療導致該模型中的腫瘤消退;(iii)樂伐替尼是 FGF 信號傳導的強抑制劑，我們假設樂伐替尼加依維莫司組合在 Caki-1 異種移植小鼠模型中的腫瘤消退至少部分是通過抑制 FGF 介導的血管生成介導的。樂伐替尼獨特的激酶抑制特性，特別是其對 FGFRs 的抑制活性，可能使其能夠克服 FGF 介導的 VEGF 信號抑制逃逸機制，并且可能至少部分地成為樂伐替尼聯合依維莫司臨床療效的基礎mRCC 患者。FGFR1 和 FGFR2 在 mRCC 中均過表達，并且 RCC 腫瘤細胞中的 FGF 信號傳導也與惡性腫瘤和對 VEGFR 抑制的內在抗性有關。RCC 腫瘤細胞中 FGFR 和 mTOR 通路的聯合靶向也可能是所觀察到的樂伐替尼聯合依維莫司臨床活性的另一個機制。然而，由于樂伐替尼在 A-498 和 Caki-1 細胞增殖試驗中的IC50值超過 5 μmol/L，我們推測樂伐替尼在這些細胞中缺乏直接的抗增殖活性。使用高度依賴于 FGF 信號傳導的 RCC 細胞系和來自對 VEGF 靶向藥物耐藥的 RCC 患者的腫瘤組織樣本進行的進一步實驗，可能會對樂伐替尼加依維莫司組合的有效抗腫瘤活性產生更多的了解。

　　總之，我們為在臨床前 RCC 模型中觀察到的樂伐替尼加依維莫司組合的抗腫瘤活性提出了一個合理的生物學原理。我們假設這種聯合治療的活性增強是由于兩種單獨化合物的以下活性：（i）樂伐替尼和依維莫司相加或協同抑制 FGF 和 VEGF 誘導的血管生成；(ii) 樂伐替尼具有有效的抗血管生成活性，而依維莫司則發揮直接的抗腫瘤作用；(iii) 樂伐替尼和依維莫司協同抑制 FGF 驅動的腫瘤生長。通過使用分子靶向藥物的組合來靶向多種致癌途徑可以增強單一療法的功效或克服與單一療法相關的耐藥性。我們在這里展示了樂伐替尼加依維莫司的組合靶向腫瘤細胞生長和血管生成。因此，與單獨靶向腫瘤細胞以及有助于腫瘤微環境的非腫瘤細胞的藥物聯合治療可能是有效抑制腫瘤的有力且有前景的概念。

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