帕納替尼(ponatinib)對FGFR2突變子宮內膜癌細胞的抗腫瘤作用

　　FGFR2 的異常突變激活與子宮內膜癌 (EC) 相關。目前正在進行臨床試驗的帕納替尼（ponatinib）已知是一種可口服的多靶點酪氨酸激酶抑制劑。我們的生化激酶測定表明，帕納替尼（ponatinib） 對野生型 FGFR1-4 和 5 個突變型 FGFR（V561M-FGFR1、N549H-FGFR2、K650E-FGFR3、G697C-FGFR3、N535K-FGFR4）具有最強的激酶抑制活性N549H-FGFR2 (IC500.5 nM) 在所有測試的 FGFR 中。因此，我們研究了帕納替尼對具有激活 FGFR2 突變的子宮內膜癌細胞的影響，并探索了潛在的分子機制。帕納替尼顯著抑制具有激活 FGFR2 突變（N549K、K310R/N549K、S252W）的子宮內膜癌細胞的增殖，主要誘導 G1/S 細胞周期停滯導致細胞凋亡。帕納替尼還降低了源自 MFE-296 和 MFE-280 細胞的免疫沉淀 FGFR2 的激酶活性，并降低了 MFE-296 和 AN3CA 細胞上 FGFR2 和 FRS2 的磷酸化。帕納替尼導致帶有 FGFR2 激活突變的 EC 上的 ERK 磷酸化、PLCγ 信號傳導和 STAT5 信號轉導顯著降低。Akt 信號通路也被帕納替尼滅活。帕納替尼主要通過阻斷 ECs 上的 ERK、PLCγ 和 STAT5 信號轉導發揮化療作用。此外，帕納替尼抑制具有 FGFR2 突變的子宮內膜癌細胞的遷移和侵襲。此外，帕納替尼顯著阻斷了子宮內膜癌細胞的不依賴錨定的生長。我們首次報告了帕納替尼對具有 FGFR2 激活突變的 ECs 發揮抗腫瘤作用的分子機制，這將為帕納替尼對 ECs 的持續臨床研究提供機制見解。

　　多種人類腫瘤，如多發性骨髓瘤、乳腺癌、前列腺癌、結腸癌和子宮內膜癌，都與 FGFR 的激活突變和過表達有關。特別是，已知 FGFR2 的激活突變與約 16% 的子宮內膜癌相關。據報道，子宮內膜樣子宮內膜癌的FGFR2表達高于非子宮內膜樣癌。作者認為 FGFR2 在子宮內膜中具有雙重功能。在正常子宮內膜中，FGFR2可以抑制月經周期的細胞增殖，但在子宮內膜癌中被視為癌基因。使用 shRNA 載體和小分子 pan-FGFR 抑制劑（如 PD173074）敲低 FGFR2 導致子宮內膜癌細胞的細胞周期停滯和細胞死亡。針對 EGFR、VEGFR 和 AKT/mTOR 信號通路的臨床評估已針對子宮內膜癌進行。然而，到目前為止，這些靶向療法的效果并不顯著和最終。激活 FGFR2 突變可能是子宮內膜癌的重要治療靶點。其他幾項研究試圖闡明帕納替尼（ponatinib）在體外和體內的抗腫瘤作用。例如，ponatinib 可抑制攜帶多維替尼耐藥 FGFR2 突變的 Ba/F3 細胞的增殖。此外，SNU16（胃癌）、UMUC14（腎癌）和 AN3CA 細胞的皮下異種移植模型被證明通過下調 FGFR 和 FRS2 磷酸化來抑制腫瘤生長。此外，通過聯合口服治療帕納替尼和 ridaforolimus 在裸鼠中抑制 FGFR2 和 mTOR 活性，在子宮內膜癌異種移植模型中發揮協同抗腫瘤作用。

　　目前正在進行臨床試驗的 帕納替尼（ponatinib）是一種有效的多靶點激酶抑制劑。在這項研究中，我們研究了帕納替尼（ponatinib）對具有激活 FGFR2 突變的子宮內膜癌細胞的抗腫瘤作用和機制。我們的生化激酶測定數據顯示，帕納替尼（ponatinib）對野生型 FGFR1-4 和 5 個突變型 FGFR（V561M-FGFR1、N549H-FGFR2、K650E-FGFR3、G697C-FGFR3、N535K-FGFR4）具有最強的激酶抑制活性在所有測試的 FGFR 中，N549H-FGFR2（IC50為 0.5 nM）。據報道，FGFR1-V561M 是對應于 Abl-T315I 和 EGFR-T766M 突變體的看門人突變體，可賦予對 FGFR 抑制劑包括 PD173074 的抗性。FGFR2 中的 N549H 突變與 Crouzon 綜合征相關這種突變通過松開激酶鉸鏈區的分子制動器以不依賴配體的方式激活激酶。另外值得注意的是，帕納替尼對 FGFR4-N535K 突變體的 IC50值為 2.44 nM，而 PD173074 對該突變體無活性。然后，我們研究了帕納替尼和 PD173074 對帶有 FGFR2 激活突變的 MFE-296 (N549K)、AN3CA (K310R/N549K) 和 MFE-280 (S252W) 子宮內膜癌細胞的細胞影響。MFE-296、AN3CA 和 MFE-280 細胞對帕納替尼和 PD173074 比具有野生型 FGFR2 的 Ishikawa 細胞系更敏感。帕納替尼（ponatinib）比 PD173074 更強烈地抑制這些子宮內膜癌細胞系的生長。FACS分析顯示帕納替尼（ponatinib）主要誘導G1/S細胞周期阻滯，導致MFE-296和AN3CA細胞凋亡。

　　低濃度 (0.1 μM) 的帕納替尼（ponatinib）顯著抑制了具有 FGFR2 激活突變的子宮內膜癌細胞中的 FGFR2 激酶活性以及 FGFR 和 FRS2α 的磷酸化。此外，帕納替尼（ponatinib）明顯降低了 ERK 和 Akt 的磷酸化。在 MFE-296 和 AN3CA 細胞中。相比之下，PD173074 不影響 Akt 在 MFE-296 和 AN3CA 細胞系中的激活，這與 Byron等人的報道一致。在測試的 FGFR2 失調的子宮內膜癌細胞中， 1攜帶 FGFR2 雙突變（K310R 和 N549K）的 AN3CA 細胞對帕納替尼最敏感。AN3CA 細胞也對 PD173074 敏感，這與之前的報告一致，盡管 AN3CA 細胞對 PD173074 的敏感性低于對 帕納替尼 的敏感性。我們發現帕納替尼對具有激活 FGFR2 突變的子宮內膜癌細胞中 PLCγ-PKCα 的激活以及 STAT5 磷酸化具有抑制作用。帕納替尼（ponatinib）對 FGFR2 下游信號傳導的減弱解釋了其對子宮內膜癌細胞的抑制遷移作用。

　　據報道，FGFRs 參與各種細胞過程，例如細胞凋亡、增殖、遷移和血管生成。抑制膠質瘤 C6 細胞中的 FGFR1 和 FGFR2 活性與減少腫瘤血管形成以及 VEGF 的表達有關。我們觀察到帕納替尼（ponatinib）能夠抑制 MFE-296 和 AN3CA 細胞的遷移和侵襲。這些發現表明，FGFR2 將成為抑制具有 FGFR2 激活突變的子宮內膜癌細胞遷移和/或侵襲能力的有效靶標。綜上所述，這無疑是帕納替尼（ponatinib）對FGFR2失調的子宮內膜癌細胞具有優異的抑制能力。此外，帕納替尼對具有激活FGFR2突變的子宮內膜癌細胞的抗腫瘤作用可能主要與阻斷ERK、PLCγ和STAT5信號轉導有關。

　　我們首次展示了帕納替尼（ponatinib）對具有激活 FGFR2 突變的 EC 發揮抗腫瘤作用的分子機制，這將為帕納替尼（ponatinib）用于 EC 的正在進行的臨床試驗提供機制見解。

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