尼達尼布(nintedanib)的體外抗新血管生成作用

　　特發性肺纖維化的特征是外周肺組織進行性瘢痕形成和硬化，從而降低肺功能。在疾病過程中，肺微血管系統經歷了廣泛的重塑。纖維化病灶周圍的血管生成增加，病灶內沒有微血管。為了闡明抗纖維化藥物尼達尼布（nintedanib）如何作用于血管重塑，我們在微流控芯片中使用了由原代內皮細胞和原代肺成纖維細胞制成的可灌注微血管的體外模型。微血管模型使我們能夠研究尼達尼布對滲透性、血管化面積和細胞-細胞相互作用的影響。尼達尼布的抗血管生成作用在 10 nM 的最小濃度下可見，顯示血管通透性顯著增加。此外，尼達尼布降低了微血管的密度、直徑，并影響了內皮微血管周圍的成纖維細胞組織。這些結果表明，尼達尼布作用于內皮網絡形成和內皮-血管周圍相互作用。因此，先進的體外微血管模型可用于確定抗纖維化藥物對 3D 微血管重塑的機制作用，并完善動物研究的結果。

　　先進的體外微流體模型可以實現生物動力學的可視化，消除種間差異，并減少要使用的細胞和試劑的數量。此外，這些模型提供了對血管化的可控研究，以開發片上模型，這些模型可在未來用于優化和開發個性化血管網絡上的藥物治療。在這項研究中，首次利用從患者健康肺組織中獲得的成纖維細胞在體外建立了一個 3D、穩定和可灌注的微血管網絡。建立該網絡后，我們研究了三重酪氨酸激酶抑制劑尼達尼布對體外人體微血管系統的影響。我們在體外證明了尼達尼布對血管通透性、血管密度、血管形態、內皮-成纖維細胞相互作用和成纖維細胞侵襲的影響。

　　在我們的模型中測試尼達尼布（nintedanib）之前，我們評估了其對濃度高達 100 nM 的 HUVEC 和 NL-FB 的單一培養和共培養的細胞毒性。Alamar blue 和活死染色分析表明，當使用尼達尼布進行高達 100 nM 的處理時，所有細胞培養物都保持其活力和增殖。這一結果與之前的報告形成對比，其中用尼達尼布處理 VEGF 或 bFGF 刺激的 HUVEC 導致細胞增殖和凋亡的抑制，EC50值分別小于 10 和 290 nM。然而，在本研究中，HUVECs 被 VEGF 和 FGF（存在于完全補充的 EGM-2 培養基中）刺激，因此預計它們對尼達尼布的毒性作用更持久。以前的研究表明，在尼達尼布濃度高達 1 μM 時，沒有證據表明對人肺成纖維細胞有急性毒性。研究還表明，尼達尼布僅在濃度大于 500 nM 時才顯著抑制肺成纖維細胞的增殖。

　　有趣的是，雖然尼達尼布（nintedanib）對細胞活力和增殖沒有不利影響，但當在微血管形成過程中在芯片上給藥時，它會在低至 10 nM 的濃度下影響體外微血管系統。為了直接比較，我們選擇的片上尼達尼布濃度約為其在人血漿中濃度的 0.7 至 1.4 倍。

　　此外，尼達尼布（nintedanib）治療的體外血管顯示血管壁的血管滲漏顯著增加。尼達尼布的片上給藥使體外微血管的通透性增加了三個數量級。尼達尼布還通過干擾內皮細胞和成纖維細胞之間的旁分泌 PDGF 信號傳導，阻止成纖維細胞延長和包裹內皮血管段。PDGF 負責血管壁中周細胞和成纖維細胞的化學吸引和增殖。在 IPF 中，除了成纖維細胞外，在內皮細胞和上皮細胞中還發現了 PDGF，這表明 PDGF 在血管重塑中的作用。抑制 PDGF/PDGFR 信號級聯會干擾成纖維細胞的化學吸引和遷移，并導致形成不穩定的微血管網絡。已知成纖維細胞的存在直接影響體外微血管的通透性和形態。血管周圍細胞包裹血管，穩定細胞間連接，增加基底膜沉積，從而降低微血管的通透性。因此，高滲漏可以通過缺乏血管周圍覆蓋和通過 PDGF 信號傳導的連接穩定性來解釋。

　　阿克曼等人據報道，尼達尼布（nintedanib）將體內血管間距增加了 1.7 倍，血管直徑從 5.1 ± 1.38 減小到 3.71 ± 1.0 μm，表明血管密度顯著降低。這些結果與我們的數據一致，表明尼達尼布治療顯著降低了體外血管密度和直徑。除了在血管生成過程中調節多種信號通路和控制內皮細胞外，VEGF 還是血管形成和發芽的主要調節因子。雖然 VEGF 在血管生成中的確切機制尚未完全闡明，但已經報道了 VEGF-VEGFR 結合的多種生物學反應：抑制內皮細胞凋亡、調節這些細胞的遷移和增殖、增加血管通透性和維持血管完整性。為了調節發芽，VEGF 的空間分布會放松細胞間的粘附，指導尖端細胞遷移并決定莖細胞的增殖。抑制 VEGF/VEGFR 信號傳導可能通過促進內皮細胞凋亡對血管完整性產生有害影響。此外，VEGF 阻斷可調節血管發芽并減少毛細血管分支。有趣的是，用特異性抗體阻斷 VEGF 可將毛細血管樣管的數量減少多達 70%，進一步證實了我們的發現。FGF 是肝素結合生長因子，可誘導內皮細胞增殖和遷移。FGF 也是通過纖溶酶原激活物表達促進 ECM 降解的血管生成初步步驟的介質。抑制 FGF/FGFR 信號可以限制內皮細胞遷移，防止 ECM 降解，并顯示出與 VEGF/VEGFR 阻斷類似的發芽效果。

　　先進的體外微血管模型為研究尼達尼布（nintedanib）等治療藥物的作用模式開辟了新的前景。這些實驗平臺可以解決藥物對血管生成和血管生成的影響的基本問題，并可用于開發和優化未來個性化脈管系統模型中的藥物治療�？傊�，我們的工作表明，臨床相關濃度的尼達尼布治療不會影響細胞活力，但會通過放松血管屏障完整性、增加通透性、縮小微血管、降低血管密度和阻止內皮血管周圍的成纖維細胞組織來顯著影響新血管生成。尼達尼布對微血管結構的影響先前已在體內進行過研究，我們的人體微血管體外 3D 模型代表了一種令人興奮的方法，因為它允許研究尼達尼布對分離的人體微血管的影響，并比體內研究更詳細地解決細胞-細胞相互作用。微信掃描下方二維碼了解更多：