外源性生長因子邁吉寧/曲美替尼的影響

　　已經表明，V600EBRAF 黑色素瘤細胞對靶向治療的反應受生長因子的影響。我們研究了三種不同生長因子 bFGF、EGF 和 HGF 單獨或聯合使用對從手術標本建立的V600EBRAF 黑色素瘤細胞群對威羅非尼和曲美替尼（邁吉寧）的反應的影響，分別針對V600EBRAF 和 MEK1/2 。

　　我們報告說，V600EBRAF 黑色素瘤細胞群的增殖和表型不受外源性生長因子的顯著影響。細胞周期中的細胞分布和CCND1表達以及對黑色素瘤發展和維持至關重要的信號通路的活性，包括 RAF/MEK/ERK 通路、WNT/β-連環蛋白通路和 NF-κB 信號通路，都不受不同生長的存在的影響因素。我們進一步表明vemurafenib 和曲美替尼消除了 ERK1/2 的活性，使細胞停滯在 G0/G1細胞周期階段，引發細胞凋亡，誘導CXCL8、CCND1和CTGF表達的變化以及 Ki-67高和 CD271高細胞的頻率。然而，在存在不同生長因子的情況下，這些影響是相似的。有趣的是，在藥物治療前長達 4 個月的時間內，在沒有外源生長因子 bFGF、EGF 和 HGF 的情況下生長的黑色素瘤細胞也獲得了可比較的結果。

　　我們得出結論，外源性生長因子 bFGF、EGF 和 HGF 的組成或缺乏不會顯著影響V600EBRAF 黑色素瘤細胞的活力和表型及其對威羅非尼和曲美替尼（邁吉寧）的體外反應。我們的結果質疑這些生長因子在用于培養V600EBRAF 黑色素瘤細胞的培養基中的必要性。

　　本研究采用的策略是用外源性 bFGF、EGF 和 HGF 替代黑色素瘤基質的旁分泌貢獻，在培養基中單獨或聯合提供，然后廣泛研究黑色素瘤細胞表型和細胞對威羅非尼的反應的可能改變和曲美替尼（邁吉寧）�；蛘�，我們評估了相同的參數，同時在缺乏外源 bFGF、EGF 和 HGF 的培養基中培養黑色素瘤細胞約 4 個月，使細胞完全依賴自分泌生長因子的產生。我們的研究沒有揭示這些生長因子對黑色素瘤活力和表型的任何實質性影響。威羅非尼和曲美替尼對活力、細胞周期、Ki-67高（密集增殖）和 CD271高百分比的影響（莖狀）黑色素瘤細胞和對黑色素瘤發展和維持至關重要的信號通路的活性，包括 RAF/MEK/ERK 通路、WNT/β-連環蛋白通路和 NF-κB 信號通路，無論生長條件如何，都非常相似，至少在治療的前 72 小時。我們不能排除生長因子依賴性信號轉導在耐藥性發展后期變得過度激活。CXCL8、CCND1、DKK1和CTGF的基因表達同樣被藥物改變，而與生長條件無關。曲美替尼和威羅非尼顯著降低CCND1的表達，在缺乏外源性 bFGF 的培養基中被曲美替尼更有效地減少。然而，這并沒有導致細胞周期 G1期的細胞積累更高，這表明盡管在 cyclin D1 轉錄物水平上觀察到顯著差異，但它們不足以影響細胞周期中的細胞分布。在V600EBRAF 黑色素瘤細胞中，細胞周期蛋白 D1 是組成型表達的。它的誘導不依賴于生長因子，主要依賴于 MEK 活化和磷酸化 ERK 的核積累。這解釋了為什么威羅非尼和曲美替尼顯著降低了它的表達。然而，其他途徑也可能參與CCND1如在其他細胞類型中所示的表達，這可能有助于在存在不同生長信號的情況下使用藥物時觀察到的細胞周期蛋白 D1 轉錄水平的微小差異。

　　雖然V600EBRAF 黑色素瘤細胞的生長因子獨立性并不令人驚訝，并且已經觀察到配體刺激對激酶成癮細胞的增殖影響很小或沒有影響，但生長因子對威羅非尼和曲美替尼（邁吉寧）的細胞反應缺乏影響是鑒于先前公布的結果很有趣。已經證明，靶向治療對靶向通路上游元件的基質介導的影響導致藥物有效性的降低。仔細檢查體外這些研究報告的結果表明，這種現象并不普遍。EGF、HGF 和 FGF 僅在一些測試的V600EBRAF 黑色素瘤中強烈拮抗威羅非尼敏感性；5 個中的 HGF、3 個中的 EGF 和不超過 8 個黑色素瘤細胞系中的不同 FGF [1]。僅在 3 個黑色素瘤細胞系中的一個 (SK-MEL-5) 中觀察到重組 HGF (0.25–50 ng/ml) 對威羅非尼類似物 (PLX4720) 抑制增殖的顯著影響。在另一項研究中，七分之一的黑色素瘤細胞系可以通過 HGF 或 FGF 從威羅非尼誘導的生長抑制中解救出來，但 EGF 沒有，并且在其他細胞系中僅觀察到“部分解救”。在另外 12 個V600E中BRAF 黑色素瘤細胞系，HGF 僅在 5 個細胞系中顯著減弱威羅菲尼的敏感性。此外，在本研究中，維羅非尼處理的 BRAF 突變黑色素瘤細胞中 cMET 表達與 HGF 拯救之間的相關性并不高 (r2= 0.56)，這表明 cMET 對微環境介導的 BRAF 抑制劑耐藥性的貢獻仍有待闡明。最近證明，cMET 臨床評分不是 BRAF 抑制劑治療的統計學顯著預測因素，并且基質或實質 HGF 表達水平并不表明腫瘤對 BRAF 抑制劑的反應。盡管在本研究中沒有研究配體誘導的受體活性，但在所有六個患者來源的樣本中，沒有一個受體可以被測試的生長因子激活的可能性很低。

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