阿法替尼afatinib和TMZ組合治療可減少細胞增殖

　　已知 EGFRvIII 可增加癌細胞的增殖、存活和調節治療反應。我們通過蛋白質印跡分析驗證了 EGFR、EGFRvIII 和 EGFRvIII DK 在 U87MG 和 U251 細胞中的表達。,并通過 MTT 法分析增殖率。與之前的報告一致 ，我們觀察到與親本 U87MG、EGFR 和 EGFRvIII DK 過表達細胞相比，U87EGFRvIII 細胞的增殖顯著增加（p < 0.0001）。。為了分析 TMZ 和阿法替尼對 GBM 的細胞毒作用，U87MG 和 U87EGFRvIII 細胞用不同濃度的 TMZ（10-500 μM）或阿法替尼（0.25-5.0 μM）處理 48-72 小時，并通過 MTT 法進行分析。在 TMZ 和阿法替尼治療后觀察到 GBM 細胞活力的劑量依賴性降低。TMZ（替莫唑胺）的 25% (IC 25) 值抑制濃度約為 25 μM 和 300 μM，而阿法替尼（afatinib）對 U87MG 和 U87EGFRvIII 細胞的抑制濃度分別為 2 μM 和 1 μM。最近，對 35 名 GBM 患者的藥代動力學分析顯示，大約 10–25 μM 濃度的 TMZ 達到腦脊液 (CSF) 因此，為了模擬體內條件，我們在所有體外實驗中使用了 25 μM TMZ 和 1 μM 阿法替尼。因此，我們的 CI 圖顯示，在 U87EGFRvIII 細胞中，阿法替尼與 TMZ 聯合使用后，細胞活力出現了額外且近乎協同的降低。

　　集落形成測定顯示，與載體處理的對照細胞相比，阿法替尼和 TMZ 均顯著降低了 GBM 細胞 U87MG、U87EGFR WT、U87EGFRvIII 和 U87EGFRvIII DK 的克隆形成性。在 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII DK 細胞中，TMZ 比阿法替尼更能抑制集落形成，而 U87EGFRvIII 細胞則相對耐藥。然而，阿法替尼與 TMZ 聯用消除了 U87EGFRvIII 細胞的集落形成能力。與載體處理的對照相比，TMZ (p= 0.01)、阿法替尼 (p= 0.03) 和 TMZ 加阿法替尼 (p= 0.01)的 U87MG 細胞集落形成百分比減少 96.3 ± 0.3、58 ± 6.2、98.4 ± 0.7， 分別。與對照組相比，TMZ、阿法替尼和聯合組的 U87 EGFR WT 集落形成減少百分比分別為 66.5 ± 1.8、41.4 ± 1.9 和 80.5 ± 1.2 (p= 0.001），分別。U87EGFRvIII 比 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII DK 細胞形成更大的集落。

　　同樣，與對照組相比，TMZ-、阿法替尼-和聯合治療組由 U87EGFRvIII 形成的菌落平均百分比減少分別為 89.6 ± 3.0、56.6 ± 7.0 和 94.5 ± 0.6。此外，與單獨使用 TMZ (p= 0.048) 或阿法替尼 (p= 0.005) 相比，阿法替尼加 TMZ 顯著減少 EGFRvIII 菌落。與對照組相比，TMZ（ p= 0.02）、阿法替尼（p = 0.02）和聯合組（p = 0.01）的 U87EGFRvIII DK 集落形成百分比分別為 85.0 ± 2.3、78.3 ± 1.5 和 95.3 ± 0.3 （p = 0.01）。總體而言，與單獨使用 TMZ 相比，聯合治療顯著降低了 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII 集落生長（p= 0.01）。對于 U251 和 U251EGFRvIII GBM 細胞觀察到類似的結果（數據未顯示）。

　　我們分析了阿法替尼是否可以阻斷 U87EGFRvIII 細胞的錨定非依賴性生長，因為 EGFRvIII 在癌細胞增殖中起重要作用，而錨定非依賴性生長可預測體內致瘤性。TMZ 顯著降低了 U87MG、U87EGFR WT 和 U87EGFRvIII DK 中的集落大小以及集落數量，而 TMZ 對 EGFRvIII 細胞的影響較小。TMZ 單獨或與阿法替尼聯合使用也顯著減少了 U87MG 小菌落 (p= 0.03) 和大菌落 (p= 0.02) 的數量。TMZ 和阿法替尼分別顯著降低了 U87EGFR WT 大集落的數量（p= 0.05)，而 TMZ 和阿法替尼聯合使用顯著減少了小菌落 (p = 0.03) 和大菌落 (p = 0.03) 的數量。

　　阿法替尼或聯合治療顯著減少了 U87EGFRvIII 小 [(阿法替尼(p = 0.02)；聯合 (p = 0.01)] 和大菌落 (阿法替尼(p = 0.02)；聯合 (p = 0.01)) 的數量。TMZ 或阿法替尼或聯合治療顯著減少U87EGFRvIII DK小菌落數（p = 0.03），而TMZ和聯合治療顯著減少大菌落數量[TMZ（p= 0.048）；聯合治療（p= 0.038）]�？傮w而言，聯合治療無論 EGFR 的激活狀態如何，阿法替尼治療都完全消除了 GBM 細胞的不依賴貼壁的生長。更多詳情可咨詢下方微信。